V molekulární biologii může být správná volba pufru a příprava různých kroků izolace DNA rozdíl mezi přechodem na expresi proteinu nebo otevřením dalšího soupravy maxi-prepar. Navzdory jejich rozhodujícímu významu jsou recepty na náplně často jen ty - recepty psané bez vysvětlení nebo odůvodnění pro jednotlivé komponenty. Jedním takovým pufrem je glukóza-tris-EDTA nebo GTE pufr.
$config[code] not foundCo je GTE používáno?
GTE se používá k resuspendaci bakteriálních buněčných pelet před lýzou (rozštěpením otevřených) buněk a skrz DNA plasmidu uvnitř. Lysozym, který změkčuje buněčné membrány, se často přidává spolu s pufrem GTE. Dosažení homogenní suspenze celých buněk během tohoto kroku, aby se následně přidaný lýzový roztok dostal do všech buněk, je klíčem k získání dobrých výtěžků DNA. GTE je navržen tak, aby poskytoval stabilní prostředí pro DNA.
Glukóza pro osmolaritu
50 mM (milimolární) glukózový cukr se přidá k GTE pufru pro udržení osmolarity, kde koncentrace rozpuštěné látky mimo buňky se blíží koncentraci v buňkách. Tím se zabrání předčasné lýze buněk, což může způsobit nižší výtěžky DNA kvůli agregaci a degradaci. Ostatní složky tlumivého roztoku přispívají k osmolaritě roztoku, avšak glukóza, která je neelektrolytem, je dobrou volbou, protože neovlivňuje vlastnosti tlumivého roztoku.
Tris pro stabilitu pH
Tris je krátký název pro tris (hydroxymethyl) aminometan, což je velmi častý pH pufr. V případě pufru GTE se do pufru přidá sůl kyseliny (Tris-HCl) v koncentraci 25 mM. To udržuje pH roztoku při téměř fyziologickém 8,0, ideálním pH pro prevenci kyselé hydrolýzy (degradace) plasmidové DNA a nežádoucích vedlejších reakcí jiných buněčných složek.
EDTA zabraňuje degradaci DNA
EDTA nebo kyselina ethylendiamintetraoctová zachycuje nebo "chelátuje" kovové ionty z roztoku a zabraňuje jim, aby se účastnili nežádoucích vedlejších reakcí. V GTE pufru se přidá EDTA při 10 mM. Jeho primárním účelem je v pufru zaokrouhlit volný zinek, hořčík a vápník, čímž se zabrání degradaci DNA určitými cestami, které tyto kovy vyžadují.
Některé důležité tipy
Udržujte svůj GTE pufr v chladu a připravte ho v malých množstvích, aby se zabránilo růstu nezamýšlených bakterií v něm. Cukr a kontrolované pH vytvářejí velké růstové médium. Vždy používejte čištěnou vodu. Voda z kohoutku může mít z trubek přebytek iontů kovů, což může přemoci schopnost EDTA zachytit. Pokud máte podezření na přítomnost rušivé RNA ve vzorku, přidejte RNase A na 100 mikrogramů na mililitr do vyrovnávací paměti GTE, abyste problém odstranili.
